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File name:哺乳动物细胞培养
Category:Protocols
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Published:2013-11-28 13:29:21
Update:2013-11-28 13:29:21
Summary:

一、试剂

1、培养基

      RPMI-1640培养基中添加10%胎牛血清,青霉素(50 U/ml),链霉素(50 U/ml)

2、冻存液

      胎牛血清中添加10% DMSO

3、PBS(pH 7.4)

      磷酸二氢钾 1.4 mM,磷酸氢二钠 4.3 mM,氯化钠 137 mM,氯化钾 2.7 mM

4、0.25% 胰酶(Trypsin)

二、实验步骤

(一)细胞复苏

1、把冻存管从液氮中取出,立即投入37℃水浴锅中,轻微摇动;

2、液体融化后(大约1-1.5 min),将冻存管取出,用酒精进行消毒;

3、将细胞悬液移至装有6 ml培养基的50 ml培养瓶中前后左右轻轻摇动,使培养瓶中的细胞均匀;

4、标记好细胞种类、日期、培养人等信息,37℃,5% CO2培养箱中培养;

5、待细胞贴壁后(大约5 h左右)更换培养基;

6、根据细胞生长状况,3天更换一次培养基。

(二)细胞传代

1、培养瓶中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代;

2、弃掉上清并用PBS缓洗2遍;

3、加入适当的胰酶液(能覆盖细胞就行,50ml培养瓶大约2ml),37℃消化 1-2 min。

4、待细胞变为球形后,弃液并加入生长液终止消化;

5、用移液枪吹打细胞,把细胞都悬浮起来;

6、把细胞分装到两个50 ml培养瓶内,继续培养。

(三)细胞冻存

1、取对数生长期的细胞(细胞覆盖率达到80%),弃上清并用PBS缓洗2遍;

2、加入适当的胰酶液(同上),把单层生长的细胞消化下来;

3、室温,1000 rpm离心5min;

4、去除胰酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存液,用吸管轻轻吹打使均匀,计数,调节冻存液中细胞的

      最终密度为5×106-1×107/ml;

5、将细胞分装入冻存管中,每管1-1.5 ml;

6、在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者等信息;

7、将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2 h,然后放入-70℃冰箱过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。

 

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